Pierwsze próby utworzenia w Krotoszynie muzeum podjęły jeszcze władze pruskie w 1913 roku, jednakże ze względu na wybuch I wojny światowej zakończyły się one niepowodzeniem. Podobnie fiaskiem zakończyła się inicjatywa utworzenia w mieście muzeum, podjęta już w okresie II Rzeczpospolitej, w roku 1926.
Muzeum Ziemi Krotoszyńskiej ostatecznie założono w 1957 roku z inicjatywy działaczy miejscowego Oddziału Polskiego Towarzystwa Turystyczno-Krajoznawczego. W gronie założycieli znajdowali się między innymi: Wanda Grabska, Franciszek Junczak, Ludwik Kaczyński, Hieronim Ławniczak, Feliks Skierkowski, Zdzisław Swora i Jan Urbaniak. W latach 1957 – 1968 siedzibą muzeum był drewniany dom podcieniowy z drugiej połowy XVIII w. przy ul. Koźmińskiej 36. Budynek ten był własnością prywatną, którą dzięki staraniom Zarządu Oddziału PTTK oraz Prezydium Miejskiej Rady Narodowej spadkobiercy właścicieli przekazali nieodpłatnie na cele muzealne. Niezbędne prace remontowe sfinansował Wojewódzki Konserwator Zabytków w Poznaniu i 27 marca 1957 roku otwarto pierwszą wystawę krotoszyńskich pamiątek.
W początkowym okresie istnienia Muzeum funkcjonowało wyłącznie dzięki pracy społecznej krotoszyńskich regionalistów. Pierwszym społecznym opiekunem zbiorów był krajoznawca związany jeszcze z tradycjami międzywojennego ruchu regionalnego w Krotoszynie, nauczyciel miejscowego Technikum Ceramicznego – Ludwik Kaczyński. W 1966 roku Zarząd Oddziału PTTK w Krotoszynie nadał Muzeum statut, na podstawie którego krotoszyńska placówka stała się jedną z kilkudziesięciu instytucji muzealnych w kraju działających pod patronatem PTTK. Dopiero od 1967 roku Muzeum dysponowało własnym budżetem oraz etatem kierownika, którym w latach 1967 – 1968 był etnograf Mirosław Rybczyński.
W roku 1969, staraniem Wandy Grabskiej – ówczesnej prezes Zarządu Oddziału PTTK w Krotoszynie, zbiory muzealne przeniesiono do barokowego budynku poklasztornego ojców trynitarzy, w którym instytucja funkcjonuje po dzień dzisiejszy. W tym samym roku miejscowy Zarząd Oddziału PTTK powołał na stanowisko kierownika placówki Hieronima Ławniczaka, nauczyciela miejscowego Liceum Ogólnokształcącego, animatora powojennego ruchu regionalnego w Krotoszynie. Muzeum pod jego kierownictwem stało się znaną i ważną dla miasta instytucją, upowszechniającą wiedzę o przeszłości i kulturze regionu. Znacząco wzrosła liczba zabytków (z około 260 do ponad 2750). Na piętrze budynku poklasztornego, w ośmiu salach o łącznej powierzchni około 270 m², powstała ekspozycja stała, ilustrująca historię miasta i kulturę ludową ziemi krotoszyńskiej. W dawnym budynku Muzeum, nazywanym „Krotoszanką”, zorganizowano wnętrze krotoszyńskiego mieszkania z przełomu XIX i XX stulecia. Hieronim Ławniczak zainicjował bogatą działalność kulturalną i edukacyjną (wystawy czasowe, lekcje muzealne, spotkania – tzw. „Czwartki Krotoszyńskie”) oraz wydawniczą („Ziemia Krotoszyńska”, „Crotosiniana”, „Kronika Krotoszyńska”). Powstała również bogata biblioteka regionalna, licząca w roku 1987 ponad 1600 pozycji. Hieronim Ławniczak zmarł 22 kwietnia 1987 roku, a od 1990 Muzeum nosi jego imię.
W lipcu 1987 roku Zarządu Oddziału PTTK w Krotoszynie zatrudnił na stanowisku kierownika Muzeum Helenę Kasperską, absolwentkę wydziału archeologii Uniwersytetu Łódzkiego. W następnych latach Muzeum kontynuowało wszystkie dotychczasowe formy działalności.
W 1989 roku Zarząd Oddziału PTTK zwrócił „Krotoszankę” spadkobiercom właścicieli, a w listopadzie roku 1998, dotychczasowy właściciel Muzeum – Zarząd Oddziału PTTK w Krotoszynie – przekazał zbiory Miastu i Gminie Krotoszyn. Od 1 stycznia 1999 roku Muzeum funkcjonuje jako samorządowa instytucja kultury.
Jeszcze w 1991 roku Urząd Miejsko-Gminny w Krotoszynie rozpoczął remont budynku poklasztornego, który z przerwami trwał do roku 2012. Prowadzone etapami prace remontowe przywróciły muzealnym wnętrzom ich pierwotny, zabytkowy klimat (między innym odsłonięto i poddano konserwacji drewniane belkowane stropy) i umożliwiły powiększenie powierzchni ekspozycyjnej. Dzięki budowie magazynu zabytków oraz instalacji systemów sygnalizacji pożaru i włamania, poprawiły się też warunki przechowywania i stan bezpieczeństwa zbiorów.
W lipcu 2013 roku dotychczasowa dyrektor Muzeum Regionalnego przeszła na emeryturę, a jej miejsce zajął wyłoniony w postępowaniu konkursowym Piotr Mikołajczyk, absolwent wydziału historii Uniwersytetu Adama Mickiewicza w Poznaniu i nauczyciel miejscowych szkół. P. Mikołajczyk pozostał na stanowisku dyrektora w wyniku konkursu ogłoszonego w roku 2018.
Obecnie ekspozycja stała mieści się w sześciu salach i na korytarzu klasztornym o łącznej powierzchni około 370 m². Wystawa składa się z trzech zasadniczych działów tematycznych: „Krotoszyn od pradziejów do współczesności” (trzy sale), „Kultura ludowa ziemi krotoszyńskiej (XIX/XX w.)” (trzy sale) oraz usytuowana na korytarzu galeria plastyczna łącząca tematy: „Krotoszyńska rzeźba, malarstwo, rysunek i grafika” oraz „Krzyże i kapliczki przydrożne na ziemi krotoszyńskiej”. Na wystawie stałej wyeksponowano ponad 1300 muzealiów.
Aktualnie zbiory Muzeum liczą ponad 6000 zabytków z dziedziny archeologii, historii, etnografii i sztuki. Najliczniej reprezentowane są zabytki historyczne (około 3700) oraz obiekty z zakresu kultury ludowej (ponad 1300). Najcenniejsze muzealia poddawane są profesjonalnym zabiegom konserwatorskim. Dzięki pomocy finansowej samorządu oraz Ministerstwa Kultury i Dziedzictwa Narodowego w minionych latach wykonano w specjalistycznych pracowniach konserwację ponad 70 obiektów, między innymi: dokumentów cechowych i okupacyjnych, archiwalnych map i planów Krotoszyna, figur barokowych i ludowych przydrożnych rzeźb drewnianych, sztandarów oraz archiwalnych egzemplarzy krotoszyńskiej prasy.
Wartość zbiorów muzealnych podnoszą bogate zasoby biblioteczne. Są to między innymi: literatura specjalistyczna, archiwalia, ikonografia, publikacje oraz opracowania niepublikowane związane tematycznie z szeroko pojmowaną historią i kulturą ziemi krotoszyńskiej. Obecnie biblioteka muzealna liczy około 5000 pozycji inwentarzowych, których część została udostępniona w intrenecie.
Od ponad 60. lat Muzeum nie tylko gromadzi i dokumentuje pamiątki przeszłości Krotoszyna i regionu ale odgrywa również ważną rolę w edukacji historycznej, kulturalnej i patriotycznej. Kilka razy w roku organizuje między innymi wystawy czasowe o tematyce historycznej, artystycznej, przyrodniczej i regionalnej, które zazwyczaj mieszczą w sali na parterze budynku, ale także na krotoszyńskim Rynku (wystawy plenerowe). Dużym zainteresowaniem cieszą się organizowane przez Muzeum imprezy cykliczne: widowiska historyczne „Święto 56 Pułku Piechoty Wlkp.” (2008 i 2009), imprezy rekonstrukcyjne „Wehikuł Czasu” (2015 – 2018) oraz krotoszyńska Noc Muzeów (2011 – 2012 i 2014 – 2018).
Ważnym elementem działalności instytucji jest organizacja spotkań i wieczornic o tematyce patriotycznej oraz historycznej. W ostatnim czasie do cieszących się największym zainteresowaniem działań tego typu zliczyć można wieczornice poświęcone Pamięci Żołnierzy Wyklętych (2014 – 2019), Powstaniu Wielkopolskiemu (2015 – 2018) oraz cykl wykładów zatytułowany „Muzealne Spotkania z Historią” (2016 – 2019).
Formą popularyzacji wiedzy na temat regionu i zbiorów muzeum jest także działalność wydawnicza. Muzeum publikuje katalogi wystaw, informatory, publikacje książkowe i broszurowe. Od 1994 roku ukazało się drukiem 13 tytułów książkowych, z których największym powodzeniem cieszy się album archiwalnych pocztówek „Pozdrowienia z Krotoszyna. Gruss aus Krotoschin” autorstwa Heleny Kasperskiej. W ostatnim czasie Towarzystwo Miłośników i Badaczy Ziemi Krotoszyńskiej we współpracy z Muzeum wydało cieszący się dużym zainteresowaniem album „Kalendarium historyczne Krotoszyna” Piotra Mikołajczyka (2015) oraz publikację „Konspiracja antykomunistyczna w Powiecie Krotoszyńskim” Daniela Szczepaniaka (2016). Ciekawymi i popularnymi wydawnictwami broszurowymi okazały się gry miejskie: zabawa przygotowana przez muzeum z okazji jubileuszu 600-lecia lokacji miejskiej Krotoszyna (2015) oraz adresowany do najmłodszych „Spacer z Jankiem” (2017).
